Esami tossicologici – review

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Dott. Giuseppe Montefrancesco

ESAMI TOSSICOLOGICI

Tecnologie e matrici per testare le sostanze d’abuso
Metodi per testare le sostanze in campioni di urine
Le principali sostanze determinabili
Esame tossicologico dell’alcol

Tecnologie e matrici per testare le sostanze d’abuso

I fattori che influenzano la scelta di un campione biologico per analizzare una sostanza, comprendono la facilità di raccolta, una serie di considerazioni di carattere analitico e l’interpretazione dei risultati. Attualmente, l’urina è il più comunemente ed ampiamente usato fra i vari metodi.
Sebbene tecnologie alternative che usano altri campioni biologici siano estremamente specifiche, non ci sono sufficienti informazioni per quanto riguarda i falsi positivi e i risultati negativi, includendo anche le interferenze e la cross-reattività.

I tempi di rilevabilità relativa di queste sostanze nei campioni biologici vanno da poche ore, a giorni, a settimane o addirittura ad anni.
In particolare:
• capelli e unghie hanno il tempo più lungo (anni);
• nel sudore la rilevabilità è nell’ordine di mesi;
• nelle urine è di giorni o qualche settimana;
• per la saliva ed il sangue si tratta di ore.

Saliva: i vantaggi di un test salivare includono la facilità di raccolta, la minima invasività sulla persona e ancor più una limitata manipolazione pre-analitica. Comunque, poiché le sostanze ed i loro metaboliti nella saliva sono generalmente proporzionali a quelli del plasma, sono normalmente presi in considerazione soltanto per interventi da compiersi entro periodi di tempo più precoci e per concentrazioni più basse se confrontate con l’urina.

Capelli: l’analisi del capello fornisce una misura retrospettiva e a lungo termine dell’uso della sostanza la quale è direttamente da porre in riferimento alla lunghezza stessa del capello. Testare il capello può estendere la finestra di rilevabilità per settimane, mesi o addirittura anni. C’è da dire però che capelli con pigmentazione scura hanno una maggiore capacità di legare la sostanza rispetto ai capelli chiari o grigi, con ciò concludendosi che il colore del capello può avere un’importanza fondamentale nella fattibilità del test. Altri svantaggi dell’analisi del capello sono la crescita irregolare, una preparazione molto laboriosa del campione da sottoporre all’analisi ed il costo eccessivo.

Sudore: la raccolta del sudore è una tecnica non invasiva e da una misura cumulativa dell’uso della sostanza a coprire un periodo che va da qualche giorno fino a varie settimane. Gli svantaggi sono la variabilità della produzione del sudore ed il rischio di rimozione accidentale o contaminazione del dispositivo per la raccolta.

Sangue: il sangue è in genere non consigliabile per test di routine poiché i campioni di sangue non sono indicati per procedure di rapido screening, hanno anche la capacità di misurare concentrazioni basse di sostanza che compensa un po’ la loro limitata finestra di rilevabilità. Comunque richiedono metodi invasivi per la raccolta del campione.

Metodi per testare le sostanze in campioni di urine

Urine: ci sono fondamentalmente due tipi di test nelle urine. Questi approcci se usati in combinazione appropriata, possono ridurre i costi, assicurare l’accuratezza ed aumentare l’efficacia. Sebbene il numero di tecnologie disponibili sia ampio, variando da dispositivi per uso singolo fino a piattaforme da laboratorio totalmente automatizzate, i due principali tipi di metodologia sono:
1.   testare le sostanze mediante saggio immunologico, sia basato su metodologie da laboratorio sia basato su metodologie più semplificate quali quelle che si fondono su uno “stick”;
2.   l’identificazione della sostanza specifica fondata su tecniche analitiche di laboratorio, ed in questo caso l’approccio specifico si fonda su due metodologie particolarmente sofisticate quali la gas-cromatografia accoppiata ad uno spettrometro di massa (GC/MS) oppure la cosiddetta cromatografia liquida ad alta performance (HPLC).
Il metodo scelto per individuare una particolare sostanza, dipenderà dalle motivazioni che hanno fatto si che il test sia stato richiesto. I test basati sul saggio immunologico sono la metodologia più comune. Tali test sono specificamente designati per classificare sostanze sia che siano presenti o assenti in base ad una soglia predeterminata di cut-off . In alcuni casi, è assolutamente necessaria una specifica identificazione della sostanza usando tecniche molto più sofisticate quali la GC/MS. Queste tecniche combinate consentono di identificare in modo accurato una specifica sostanza e i suoi metaboliti.

Immunoassay
Il saggio immunologico, che è fondato sul principio del binding competitivo, utilizza anticorpi per scoprire la presenza di una particolare sostanza o metabolita in un campione di urina. Una determinata quantità di anticorpo è la sostanza o il metabolita che è stato marcato con un enzima, vengono aggiunti al campione di urina. La sostanza o il metabolita nel campione competeranno con la sostanza marcata o il metabolita di essa per legare l’anticorpo e quindi formare il complesso antigene-anticorpo. La quantità di enzima-marcato antigene che lega con l’anticorpo è inversamente proporzionale alla quantità di sostanza presente nel campione.

GC/MS
La gascromatografia combinata con uno spettrometro di massa che funge da detector estremamente sofisticato, consente il riconoscimento univoco di qualunque sostanza d’abuso anche presente in tracce minime. Questa tecnica non può essere assolutamente contestata poiché lo spettro di massa risultante alla fine di tale procedimento è come un’impronta digitale, ossia assolutamente unico. Naturalmente tale tipo di indagine viene solitamente riservata a quei casi, normalmente forensi in cui si deve con assoluta certezza individuare precise responsabilità conseguenti all’assunzione di sostanze stupefacenti.

Le principali sostanze determinabili

Le principali sostanze d’abuso che vengono normalmente o più frequentemente analizzate sono:
• la cocaina
• le amfetamine e la metamfetamina
• l’MDMA (ecstasy)
• i vari tipi di oppiacei (eroina, metadone)
• i cannabinoidi (marijuana)
• la ketamina
• il GHB
• le benzodiazepine.
Queste sono le sostanze che ruotinariamente e con metodiche semplificate, molto spesso semplicemente qualitative e non quantitative, vengono più comunemente impiegate per stabilire la loro presenza o assenza. Naturalmente però è possibile individuare sostanze in modo più specifico e semiquantitativo o quantitativo con l’impiego di altre metodiche già descritte.
Questo avviene per esempio qualora volessimo riconoscere in un campione di urine la presenza di codeina, morfina, idrocodone, idromorfone, oxicodone, fentanyl e buprenorfina.

E’ importante sottolineare quali sono i tempi di riscontrabilità nelle urine di alcune di queste sostanze considerando, in ogni caso, che tali tempi sono approssimativi (in forma di stima) e dipendenti da numerosi fattori quali:
• la via di somministrazione (di assunzione);
• purezza della sostanze;
• la frequenza d’uso;
• variabilità individuali che influenzano la frazione assorbita, la frazione metabolizzata, la
• distribuzione nell’organismo, la frazione eliminata;
• la quantità assunta (maggiore è la dose più lungo è il periodo di rilevabilità nelle urine);
• consumo di liquidi
• la sensibilità e i limiti del metodo utilizzato.
Quindi può accadere che, in alcuni casi, quanto riportato nella tabella sottostante possa essere contraddetto.

Tempi approssimativi di rilevabilità nelle urine

Amfetamine 2-3 giorni
(metaboliti delle metamfetamine)
Metamfetamine (singolo uso) 1-3 giorni
Metamfetamine (uso ripetuto) 3-5 giorni
MDMA (ecstasy) 2-4 giorni
Eroina minuti
Morfina (metabolita dell’eroina) 2 giorni
Metadone 7-9 giorni (in regime di mantenimento)
Cocaina (immodificata) poche ore
Benzoilecgonina (metabolita della cocaina) da 2 a 3 giorni e per dosi elevate fino ad una settimana
Cannabinoidi (singolo uso) da 2 a 4 giorni
Cannabinoidi (uso moderato 4 giorni es. 4 volte la settimana)
Cannabinoidi (uso “pesante” e cronico) 3 settimane o anche più
Ketamina 2-4 giorni
PCP 8 giorni approssimativamente
GHB 12 ore
Benzodiazepine da 12 ore a 7 giorni (dipende dalla semivita dell’ansiolitico)

Esame tossicologico dell’alcol

L’alcol si ricerca normalmente nell’area alveolare (test al palloncino) o nel sangue e permane nell’organismo per poche ore.
L’alcol viene:
• per oltre il 90% ossidato dal fegato;
• il 5-10%, viene escreto invariato nell’aria espirata, nelle urine e nella saliva.

Il rapporto tra la concentrazione di etanolo nel sangue e aria alveolare, dopo 15 minuti, è costante
e ad es., 80mg/100 ml di etanolo nel sangue producono 35 ng/100 ml di etanolo nell’aria espirata (alla fine di una profonda espirazione).
Questo spiega l’attendibilità della correlazione tra alcol presente nel sangue e alcol rilevato nell’espirato, la validità dell’etilometro e in ultima analisi la validità della misura dello stato di ebbrezza di una persona con il “test al palloncino”.
Nei controlli stradali è necessario procedere a 2 misurazioni a distanza di almeno 5 minuti per evitare che la presenza di alcol nel cavo orale non influisca sul risultato di una sola misura, mentre deve essere concorde per entrambe.

Le urine, al contrario, raggiungono la massima concentrazione di alcol in tempi diversi da quelli ematici, circa 2 ore dopo.
L’alcol così presente nelle urine, l’alcoluria, è modificato dalla diuresi e da altri liquidi che fortemente incidono nel valore della sua concentrazione e quindi fornisce un valore meno accurato dell’eventuale concentrazione ematica.

La maggior parte dei farmaci, come altre sostanze esogene, vengono eliminati dall’organismo ad una velocità che dipende dalla quantità presente di questi. Per l’alcol ciò avviene solo a concentrazioni molto basse e clinicamente non significative, cioè pari a 0,2 grammi/litro.
Quando al contrario la concentrazione di etanolo è più elevata, il processo di ossidazione epatica si satura e allora la velocità di eliminazione diviene costante e indipendente dalla concentrazione.
Un adulto può metabolizzare 7-10 g di alcol in 1 ora e ciò equivale, circa:
—  a meno di una bevuta di una lattina di 330 ml di birra
—  a meno di un bicchiere di 125 ml di vino di 12°
—  a meno di un distillato alcolico di circa 40ml.
Si ricorda che:
1 bicchiere di vino, 125 ml, di 12 ° (o al 12% di alcol), contiene 12 grammi di alcol.

 

Riferimenti bibliografici

Kapur B.M., Bulletin on narcotics, Drug testing in the workplace, volume XLV, n° 2, 1993,pag. 115-154.
Fuceri F. et al., Reducing False-negative tests in urinary drug of abuse screening, Journal of Analytical Toxicology, Letter to the Editor, 1997,21, pag. 244.
Nida, Research monograph series, Drug testing for drugs of abuse, 1987
Cowan D. et al., Drug testing, Foresight Brain Science, Addiction and drug project, 2005.